澳门京葡网站:观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层,①动物细胞比微生物细胞大得多

核心提示: 一、前言
动物细胞培养开始于本世纪初1962年,动物细胞培养规模开始扩大,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛

核心提示:细胞培养是将器官、组织或细胞从生物机体中取出,模拟该器官、组织或细胞在机体内的生理条件,在体外进行培养,使其能够继续生存细胞培养是将器官、组织或细胞从生物机体中取出,模拟该器官、组织或细胞在机体内的生理条件,在体外进行培养,使其能够继续生存、生长和繁殖。一些研究结果表明,许多种类的动物或植物的细胞都能在人工培养条件下生存、生长和繁殖。现代的动物细胞培养始于美国动物学R.G.Harrison。他于1906年在无菌条件下,以淋巴液做培养基,培养了蝌蚪的神经板,并观察到神经细胞突起生长的过程。到了20世纪后半叶,随着分子生物学和细胞生物学的崛起,为了在活细胞中研究生命现象,细胞培养方法得到了广泛的发展和应用。细胞培养的突出优点,一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响。因为人工培养条件易于改变,并能得到严格的控制,有利于单因子分析。二是细胞培养便于我们对细胞生长、发育过程的观察,可以用显微镜直接观察亦可应用显微缩时电影技术记录其进程。因而,细胞培养是探索和解释细胞生命活动规律的一种简而易行的技术。然而,细胞培养方法也有其局限性,由于培养的细胞生活在脱离了机体的复杂的环境条件下,其生态环境和细胞之间的相互关系都改变了,因此,其细胞生物学性质必然也会发生某些改变。所以在人工培养条件下观察到的结果难于正确反映细胞或组织在机体内部的状况。这一点是我们在应用此技术进行研究时应该注意的。尽管如此,由于细胞培养技术的优点是其他实验方法和技术所不能比拟的,所以近年来,细胞培养技术在分子生物学、遗传学、老年学、免疫学、肿瘤学和病毒学等很多领域都得到了广泛的应用,并取得了很多重大的成果。细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存,必须模拟体内环境,共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子;氧气及适宜的温度;注意调节其外环境的酸碱度与渗透压;以及为排除细胞代谢产物的危害,保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。一、目的与要求通过本实验了解原代细胞与传代细胞培养的基本方法以及在细胞培养过程中严格的操作程序。初步掌握无菌操作的基本原则,认识无菌操作在细胞培养中的重要性。二、实验内容1、原代细胞的制作――示范2、传代细胞的传代三、实验步骤原代细胞的制作――以乳鼠肾细胞原代单层静置培养为例,按实验时操作的顺序进行描述。1.
操作者首先进行手的清洗与消毒,再将实验用品放在合适的位置,然后配置营养液及调节平衡盐液的pH值。2.
配液 乳鼠肾细胞营养液的配置:0.5%LH液 90%犊牛血清
10%1万单位/ml青、链霉素 加至约100单位/ml7.4%NaHCO3 调pH至6.8~7.0
平衡盐液-Hank液的调节:用7.4%NaHCO3调Hank液的pH至6.8~7.0
调胰蛋白酶的pH值25%胰蛋白酶溶液中加入数滴NaHCO3,充分混匀,使其pH值为6.8~7.0。3
处死动物
在动物细胞培养中,为避免过多血细胞的干扰,一般采用剪断动物颈动脉放血的方法处死动物,然后用水浸湿体表的被毛。将动物固定在解剖板上,使其背部向上,先用碘酒棉球消毒背部的被毛,然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。
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取肾在腰部的后缘,用解剖剪提起皮肤,剪开皮肤,将剪开的皮肤分别拉向两边。此时,再换一把解剖剪及解剖镊,剪开背部的肌肉,暴露出腹腔,即可见到肾脏(一般右肾略低于左肾),用弯头眼科镊取出肾脏,置于无菌培养皿中。5
剪肾用眼科剪及镊,将肾膜剪破,并将其剥向肾门,去肾膜及脂肪。再用Hank液洗涤一次,再将洗过的肾脏转入另一培养皿中。另换一把眼科剪及镊,沿肾脏的纵轴剪开,去掉肾盂部分,将肾剪成数块,然后用Hank液洗涤一次。将洗过的肾块转移入无菌的青霉素瓶中。用弯头眼科剪,将肾剪成1立方毫米大小的块,组织块的大小应尽量均匀一致,再用Hank液洗涤2~3次,直到液体澄清为止。6消化及分散组织块将上步清洗过的Hank液吸掉,按组织块体积的5~6倍量加入0.25%胰蛋白酶液。置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20~40分钟左右(消化时间的长短与多种因素有关,如蛋白酶的活性及浓度,不同动物及年龄,组织块的大小等等)。每隔10分钟摇动一次青霉素瓶,以便组织块散开,以利于继续消化,直到组织变成松散、粘稠状,并且颜色略变为白色为止。这时可从水浴中取出青霉素瓶,吸去胰蛋白酶液,再用Hank洗涤2~3次。然后,加入少量乳汉液,用吸管反复吹打组织块,直到大部组织块均匀分散成混淆的细胞悬液为止。此时,可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布进行过滤,以除去部分较大的组织碎片。7
计数与释稀从上步滤过的细胞悬液中吸取1ml细胞液,进行计数。将细胞滴于血细胞计数板上,按白细胞计数法进行计数,计数后用营养液进行稀释,稀释后的浓度一般为每ml含细胞30~50万为宜。8
分装与培养
将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中(一般5ml/小方瓶,1ml/青霉素瓶),盖紧瓶塞,注意瓶塞一定要紧。在培养瓶的上面做好标记,以免培养瓶放反,并在瓶口处注明细胞,组别及日期。然后放于培养架上,并轻轻摇动培养架,避免细胞堆积,以便细胞能均匀分布。最后将培养瓶置于37℃条件下进行培养。9
观察 置于37℃培养的细胞,需逐日进行观察,主要观察:
培养物是否被污染,如培养液变为黄色且混浊,表示已经被污染。
细胞生长状况与培养液颜色的变化,如培养液变为紫红色,一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。
培养液若变为桔红色,一般显示细胞生长良好。经过1~2天的培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红了,则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作,在酒精灯旁,倒去原培养液,再加入等体积的新配营养液,pH7.0。若经2~3天后,细胞营养液变黄,此时表示细胞已生长。如果希望细胞长得更好些,此时也可换液,换液时,所用的营养液称为维持液,它与营养液的组成完全相同,仅所用血清为5%。以后,每隔3~4天(视细胞液pH值而定)更换一次维持液。待细胞已基本长成致密单层时,此时即可进行传代培养。传代细胞的传代在做传代细胞培养之前,首先将培养瓶置于显微镜下,观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层,如已长成致密单层,即可进行细胞的传代培养。
各种传代细胞的传代方法基本相同,只是各种细胞所需的营养液成分有差别,现以HeLa传代细胞系为例介绍细胞传代的基本方法。
1.首先配制营养液 E-EM液 90% 犊牛血清 10% 双抗 约100单位/ml 3%谷氨酰氨
1ml 7.4%NaHCO3 调pH至7.0~7.2
2.在酒精灯旁打开瓶塞,倒去瓶中的细胞营养液,然后加入适量的无钙,镁离子的PBS液,轻轻摇动,将溶液倒出。
3.消化与分装
在上述瓶中加入适量消化液(0.02%EDTA或0.04%EDTA+0.5%胰蛋白酶液各一半)以盖满细胞为宜,置于室温,停留2~3分钟,翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层是否出现缝隙,如出现缝隙,即可倒去消化液,如未出现缝隙,则可将瓶翻回,继续进行消化,直到出现缝隙为止(消化时间的长短与不同的细胞及生长状态有关)。此时,可倒去消化液,加入新配置的营养液3ml,以中止消化。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液,反复吹打瓶壁上的细胞层,直到瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时,可继续轻轻吹打细胞悬液,以使细胞散开。随之即可补加营养液,细胞传代的比例,不同的细胞亦不同,HeLa细胞一般以1:2或1:4进行分装,即一瓶细胞可分装两瓶。若原瓶为5ml营养液,要分装成两瓶,则需补液到10ml,混匀,即可将另一半分装至另一瓶中。

一、前言

动物细胞培养开始于本世纪初1962年,动物细胞培养规模开始扩大,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,动物细胞培养已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。目前,动物细胞有悬浮培养和贴壁培养.技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。

二、动物细胞的特点及生长特性

动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用抗生素;③培养过程需氧量少;④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50
代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。
三、动物细胞的固定化培养技术

1、固定化培养方法

在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性,另外多糖
由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害,故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。

吸附

①多孔陶瓷

美国某公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统,该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体,可提供4.
25 m2
的生长表面积,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大。

②微载体

微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒
,使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面,1g微载体其比表面积可达
6000cm2,从而可实现细胞的高密度培养。

微载体的直径在60~250μm
,由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成,如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性,在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质,因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。采用微载体培养具有以下优点:
①比表面积大,单位体积培养液的细胞产率高;②采用均匀悬浮养,无营养物或产物梯度;③可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况;④细胞收获过程相对简单,劳动强度小;⑤培养基利用率高,占地面积小;⑥放大容易,国外已有公司以1
000 L 规模培养人的二倍体细胞来生产β-
干扰素。但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞;接种密度高;微载体吸附力弱,不适合培养悬浮型细胞。

③大孔微载体

人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积,开发了具有完全连通沟回的大孔微载体。

大孔微载体将细胞固定在孔内生长,因而与其他方法相比具有一系列优点:
①比表面积大,是实心微载体的几倍甚至几十倍;②细胞在孔内生长,受到保护,剪切损伤小;③与包埋法相比,传质尤其是传氧效果好;④两种类型细胞都适用;⑤细胞三维生长,细胞密度是实心微载体10倍以上,有的可108个/
mL;⑥适用于长期维持培养,细胞生长情况依然良好;⑦微载体浓度高,实心载体在培养液中浓度增大到一定时,细胞密度反而下降;而大孔微载体在浓度较高时,表面碰撞增加,能促使细胞在孔内生长;⑧最适合于蛋白质生产和产物分泌。因此有人预言,大孔微载体质生产和产物分泌。因此有人预言,大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。

包埋

将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。此法步骤简便,条件温和,负荷量大,细胞泄露少。因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护,细胞能抗机械剪切。但该法也有一定缺点,如扩散限制,并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。多孔凝胶是最常用的载体,用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。

①海藻酸钙凝胶

海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻酸钠溶液混合均匀,然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中形成直径约1mm内含动物细胞的海藻酸钙胶珠,分离洗涤后即可用于培养。此法操作时条件温和,对活细胞损伤小。但固定后机械强度不高。为了大量制备海藻酸钙凝胶包埋的固定化细胞,国外已有专门的振动喷嘴设备可供使用。

②琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶可用二相法制得。将含有细胞的琼脂糖溶液分散到一个水不溶相中
,形成直径0.2mm凝胶珠珠,移去石蜡油后,细胞即可进行培养。同海藻钙一样,琼脂糖更适于培养悬浮细胞。尽管凝胶珠形成过程很复杂,目前放大体积不超过20
L。但琼脂糖凝胶无毒性,具有较大的空隙,可以允许大分子物质自由扩散,因此该法特别适用于蛋白产物的连续生产。有人曾用琼脂糖包埋杂交瘤细胞和淋巴细胞生产单克隆抗体和白细胞介素。

③血纤维蛋白

将动物细胞与血纤维蛋白原混合,然后加入凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白,将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁,因此两种类型的细胞都适于培养。而且基质高度多孔,允许大分子物质的自由扩散。但机械强度差,对剪切力很敏感。

中空纤维

中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态,利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。

中空纤维培养技术的优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入,使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。缺点是膜的污染和堵塞,观察困难,细胞生长或过量气体产生会破坏纤维。中空纤维培养技术的发展趋势是让细胞在管束外空间生长,以达到更高的细胞培养密度。目前中空纤维反应器已进入工业化生产,主要用于培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体。

微囊化

微囊化培养技术其要点是:在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行培养。生长介质为1.4%海藻酸钠溶液,半透膜由多聚赖氨酸形成。培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统。实验证明,采用批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体,在7~27
d微囊内抗体浓度可达1250~5300 mg/
L。利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞,形成免疫隔离的人工细胞,以此植入疾病动物或病人体内。1980
年报道了微囊化胰岛移植治疗大量实验性糖尿病。他们将同种大鼠胰岛用海藻酸-
聚赖氨酸-
聚乙烯亚胺包埋后植入链脲霉素诱导的糖尿病大鼠体内,在未用免疫抑制剂的情况下,控制大鼠血糖正常达一年左右。

胶囊化培养的优点是:
①可防止细胞在培养过程中受到物理损伤;②活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜,从而提高细胞密度和产物含量,并方便分离纯化处理。缺点是:
①微囊制作复杂,成功率不高;②微囊内死亡的细胞会污染正常产物;③收集产物必须破壁,不能实现生产连续化。

2、固定化方法的选择

培养规模

由于各种固定化系统可以获得相同的细胞密度,且细胞的产率主要取决于细胞的扩散,因此反应器的体积是培养规模放大的主要决定因素。虽然微载体系统可以提供最大的单元操作,但其他系统也可以通过增加单元套数而获得放大。

培养方式

除了海藻酸钙包埋法外,其他固定化基质都是多孔型的,能允许大分子物质自由出入,因此可实现蛋白质产物的连续生产。在凝胶珠和微囊中可使蛋白产物积聚到很高的浓度,给后续的分离纯化处理带来方便,并大大降低了生产成本。

所培养的细胞类型

大多数固定化系统都适用于贴壁型细胞的培养。而在吸附非贴壁型细胞时,由于吸附力弱容易出现细胞泄露。

制备方法的难易和成本

由于固定化基质是由制造商在不同的竞争时期提供的,因此各种固定化方法的成本很难比较。海藻酸盐和琼脂糖是以化学试剂形式出售;胶原珠是以无菌形式提供给使用者,以便于接种。

3、固定化培养存在的问题

固定化细胞培养的细胞密度较一般悬浮培养高10~100
倍,但同时也带来了如何保证足够的营养物质和氧的传递问题。

细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手的问题。包埋在凝胶或微囊中死亡的细胞会对其他细胞产生污染和毒害作用。

培养基及固定化基质价格昂贵,生产成本高居不下。尤其是高效的微载体细胞培养介质,销售价格一直呈上涨趋势。

目前对细胞代谢和生长动力学的研究以及在线监测水平还远不足以设计出确定的优化培养系统,从而导致昂贵培养基的浪费。

4、固定化动物细胞培养的展望

固定化动物细胞培养工程发展的总方向是大型化、自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产量。从国际上的发展趋势看,动物细胞培养技术主要有:开发细胞培养反应器和培养系统;
开发培养贴壁细胞的载体; 开发微囊技术; 开发杂交、重组技术;
开发无血清和化学合成的培养基; 蛋白质浓缩和提纯技术。

四、动物细胞的灌注培养技术

动物细胞培养同传统的微生物细胞培养相比,动物细胞培养存在着细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对营养的要求高、对外界环境如温度、pH、溶氧、渗透压、剪切力的敏感性强、细胞状态容易改变等问题,大大增加了动物细胞培养的难度。如何完善细胞培养技术,提高动物细胞大规模培养的产率,一直是国内外研究的热点之一。

1、灌注培养原理

常用的动物细胞培养方法有分批培养、补料分批培养、连续培养,但产率一直不高。直到六十年代,灌注培养技术的出现,为动物细胞高密度大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的三十年中,灌注培养技术得到了迅速地发展,已成为动物细胞大规模培养的主要方法。

在灌注培养中,细胞保留在反应器系统中,收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分,并可带走代谢产物,同时,细胞保留在反应器系统中,可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比,灌注培养的产率可以提高一个数量级,并可大大降低劳动力消耗。

灌注培养主要可分为两大类:悬浮灌注培养和床层培养。悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上,加上一个细胞分离器而成,以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见。床层培养则把细胞直接保留于床层,不需要细胞分离器,其中堆积床和大孔载体培养的应用较广。

2、灌注培养方法

在灌注培养前,对动物细胞的生长和生理特性进行充分的考察,是十分必要的,能为灌注培养提供有益的参考。以比生长速率为例,大量实验表明,细胞的比生长速率降低时,产物的比生长速率提高,有人控制细胞的比生长速率为最大比生长速率的60%抗体生长速率增加了97%。灌注培养可以从两个方面入手,一是改变动物细胞的培养环境,实行阶段培养;二是进行代谢调控。